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Phoreusbiotech支鏈兩親性肽膠囊在昆蟲飼料中傳遞致死性 dsRNA 的研究。

Avilaa，b，，1，R. Chandrasekarb，1，K.E.巴爾薩佐布，c，M。希爾曼布，J。貝查德布，S。布朗德，Y.Parke，S.Dharf，G.R。Reeckb J.M.托米克巴生物科學系，奧本大學，奧本，AL 36849，美國阿布生物化學 & 分子生物物理學，堪薩斯州立大學，KS 66506-3902，美國化學系，富特海斯州立大學，KS 67601-4099,美國生物學部，堪薩斯州立大學，KS 66506-3902，美國昆蟲學系，堪薩斯州立大學，KS 66506-4004，美國物理系，奧本大學，奧本，AL 36849，美國

開發(fā)新的和特定的害蟲管理方法對于克服殺蟲劑抗性和附帶的非目標害是至關(guān)重要的。通過向昆蟲提供 dsRNA 來實現(xiàn)基因沉默在這一領(lǐng)域顯示了希望。在這里，我們描述了一種多肽納米材料的使用，分支兩親肽膠囊(BAPC) ，促進細胞攝取雙鏈 RNA 的昆蟲通過喂養(yǎng)。昆蟲飼料包括與 BAPC 絡(luò)合的和不與 BAPC 絡(luò)合的 dsRNA。選取的昆蟲品種來自兩個不同的目，以不同的取食機制: 赤擬谷盜和碗豆蚜。測試的基因轉(zhuǎn)錄本(BiP 和 Armet)是未折疊蛋白反應(yīng)的一部分，抑制它們的翻譯會導致致命性。對于無芒草屬，與攝入相同量的游離 BiP-dsRNA (t1/2 = 11-12天)相比，攝入與 BAPC 相關(guān)的 BiP-dsRNA 導致蚜蟲過早死亡(t1/2 = 4-5天)。使用 BiP-dsRNA 和與 BAPC 復合的 Armet-dsRNA 的組合有效地殺死赤擬谷盜; 大多數(shù)在幼蟲或羽化期間死亡(? 75%)。單獨喂食 dsRNA 導致較少的死亡(約30%)。結(jié)果表明，雙鏈 RNA 與 BAPC 的復合增強了雙鏈 RNA 的口服遞送。1.前言我們最近描述了一類由支化兩親肽膠囊(BAPCs)制成的新型納米材料[1]。這些納米膠囊具有不尋常但非常理想的特性，可以解決與其他納米顆粒相關(guān)的一些缺點[2]。例如，它們是水溶性的，在血液中穩(wěn)定，*由天然氨基酸制成[3]。它們顯示大小(取決于退火條件) ，范圍從10到50納米，并耐洗滌劑，蛋白酶和混沌[4,5,6]。本研究中使用的 BAPC 由兩種分支肽: 雙(AcFLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和雙(Ac-FLIVI)-K-K4-CO-NH2的等摩爾混合物組成，并且來源于人心臟 L 型二氫吡啶敏感鈣通道的孔形成片段之一[1]。這些納米膠囊有望作為一種替代的非病毒核酸載體，體外和體內(nèi)系統(tǒng)[3]。在體外，DNA-BAPC 納米顆粒已被用于轉(zhuǎn)染多種細胞系，包括 HEK, HeLa 和小鼠樹突狀細胞的轉(zhuǎn)染效率高于普遍使用的基于脂質(zhì)的商業(yè)產(chǎn)品，細胞毒性可以忽略不計[3]。在體內(nèi)，BAPC 能夠在小鼠體內(nèi)傳遞編碼 HPV-16(pgDE7) E7癌蛋白的疫苗 DNA。用 pgDE7-BAPC 納米膠囊復合物免疫的小鼠在腫瘤細胞移植后一個月內(nèi)抑制腫瘤生長，沒有明顯的毒性作用[3]?；趦煞N不同成像技術(shù)的物理 BAPC/DNA 相互作用的研究揭示了平均大小在50nm3到250nm3之間的致密團簇。與 DNA 的組蛋白壓縮形成核小體相比，20-30nm 的 BAPC 與質(zhì)粒 DNA 相互作用，作用于帶負電荷的 DNA 與外表面結(jié)合的無性成核中心[3]。這些結(jié)果表明，BAPC 促進質(zhì)粒 DNA 和其他類型的核酸，如小寡核苷酸或 RNA 的攝取。DsRNA 進入細胞是當代分子生物學中最有用的工具之一的第一步: 通過RNAi [7,8].基于 RNAi 的轉(zhuǎn)錄本敲低已經(jīng)在許多目的昆蟲中使用，并且是昆蟲反向遺傳學工具箱的關(guān)鍵部分[9]。DsRNA 構(gòu)建體已經(jīng)通過顯微注射到血淋巴中，主要用于昆蟲[10]。雖然有效，但注射也有其局限性，包括治療大量昆蟲的單調(diào)乏味和注射較小的昆蟲種類(或發(fā)育早期)的困難。除了注射，諸如浸泡[11]和攝取的方法已經(jīng)被探索，但成功和重復性有限。最近，一些研究表明，攝取與納米材料相關(guān)的 dsRNA 可以增強沉默活性[12,13,14]。已經(jīng)觀察到陽性結(jié)果形成 dsRNA 與陽離子脂質(zhì)和修飾的多糖如殼聚糖的復合物[12]。然而，盡管這種進展，RNAi 效應(yīng)是低和高度可變的。該領(lǐng)域的共識，主要來自不成功的，因此未發(fā)表的研究，是喂養(yǎng)昆蟲的 dsRNA 在好的情況下是低效的，在最壞的情況下是*無效的[8]。在這項研究中，BAPC 被測試的能力，促進攝取 dsRNA 的昆蟲通過喂養(yǎng)，以增強轉(zhuǎn)錄敲低。昆蟲飼料包括含有和不含有 BAPC 絡(luò)合物的 dsRNA。選擇的昆蟲種類來自不同的目和不同的取食機制: 赤擬谷盜(Tribolium castaneum)用改良的固體面粉飼料喂養(yǎng)紅粉甲蟲，豌豆蚜(pea aphid)用人工液體飼料喂養(yǎng)碗豆蚜。這兩種昆蟲的基因組序列已經(jīng)發(fā)表。Tribolium 是一個主要的遺傳模型，其中通過 dsRNA 注射的轉(zhuǎn)錄敲低可能比任何其他昆蟲物種更有效[17]。此外，它還是一種與人類生物化學和細胞生物學過程有關(guān)的模式生物[17]。作為這兩個物種的主要靶標，我們選擇了 BiP (GRP78)的轉(zhuǎn)錄本。它的活性在未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)中是重要的[18]。對于 Tribolium，我們包括另一個普遍定期審議成員 Armet (也稱為 MANF)的轉(zhuǎn)錄本[19]。在 Tribolium 的一個單獨的實驗中，我們敲除了 Vermillion 轉(zhuǎn)錄本，作為*內(nèi)部器官中的轉(zhuǎn)錄本的例子(與腸道相反，腸道是敲除 BiP 和 Armet 轉(zhuǎn)錄本的可能作用部位)。*編碼的氧化酶，所需的棕色眼睛色素合成在 Tribolium [20]。攝食 BAPC-Vermillion-dsRNA 復合物導致處理昆蟲眼睛顏色不深。在另一個實驗中，用 BAPC/dsRNA 復合物處理后，熒光標記的 dsRNA 定位于解剖的成年 Tribolium 的內(nèi)臟。RNAi 技術(shù)在消除病蟲害方面具有巨大的潛力，但需要進一步的實驗來確定可獲得的細胞靶標中的合適的基因靶標，使用的方法可以很容易地縮放。本報告中描述的生物膠囊促進了在體內(nèi)口服遞送具有高效率和低細胞毒性的 dsRNA (納米膠囊單獨使用)的系統(tǒng)。形成膠囊的自組裝肽容易以高純度合成，在純水中組裝，并且可以在存在 dsDNA 或 dsRNA 的情況下在復水之前長時間儲存。這些肽的合成很容易被縮放到多重水平，并且每次處理所需的 μM 濃度較低，使用這些載體的成本應(yīng)該使得任何研究人員都可以使用這種工具來在高價值的情況下控制害蟲。

材料及方法2.1。多肽合成如前所述合成并切割支化的兩親肽雙(Ac-FLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和雙(Ac-FLIVI)-K-K4-CO-NH2[1]。切割后的肽用二洗滌三次，溶于水中，凍干后放入室溫下保存。反相高效液相色譜純化多肽，基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行(MALDI TOF/TOF)進行表征。雙(Ac-FLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和雙(Ac-FLIVI)-KK4-CO-NH2分別溶于純2,2,2-三氟乙醇(TFE)中，并以等摩爾比混合在一起，最終濃度為1mM。使用在257.5 nm (195cm-1M-1)水中的摩爾吸收率(ε)計算肽濃度?；旌虾螅麄冊试S停留10分鐘，然后在真空下除去溶劑。將1mL 水滴入干燥的肽混合物中，并使其在25 °C 下靜置30分鐘，以1mM 終濃度形成膠囊。隨后，將含有溶液的膠囊在4 °C 溫育1小時以防止膠囊融合[4]。1小時后，將肽樣品放回25 °C 30分鐘，然后干燥，進行對數(shù)貯存或與 dsRNA 混合。2.3.DsRNA-BAPC 納米顆粒的制備為了處理10只赤擬谷盜甲蟲，將含有10μg Armet、 BiP 或*的200μL 水溶液分別滴加到含有400μMBAPC 的200μL 水溶液中，或?qū)?span> Armet 和 BiP 一起滴加到200μL 水溶液中。對于用 BiP-dsRNA 和 Armet-dsRNA 的組合處理的組，我們加入每種5μg 并以400μM 與200μL BAPC 混合。溶液通過移液管小心地混合，并允許在加入 CaCl2之前停留10分鐘，以產(chǎn)生1.0 mM 的最終濃度。培養(yǎng)30分鐘后，將溶液與昆蟲飼料混合。為了處理5種碗豆蚜蚜蟲，將0.1 μg 的 Acyrthosphopisum BiP-dsRNA 溶于10μL 水中。隨后，將該溶液滴加到含有200μM BAPC 的10μL 溶液中。溶液小心地與移液管混合，并允許在加入產(chǎn)生1.0 mM 最終濃度的 CaCl2之前停留10分鐘。在另外10分鐘的疾病潛伏期后，加入蔗糖(500毫米)。對于用較少量 BiP-dsRNA 處理的昆蟲，如上所述制備的 BAPC/核苷酸復合物在加入 CaCl2之前用水稀釋10倍和100倍。

2.4.動態(tài)光散射(dLS)和 zeta 電位(ZP)如前所述制備了不同的 dsRNA-BAPC 制劑(dsRNA-BAPC 納米顆粒的制備)。所有樣品的粒徑和 zeta 電位均使用 Zetasizer Nano zS (Westborough 馬薩諸塞州莫爾文儀器有限公司)測定。樣品在 CaCl2(2mM)中分析，所有測量一式三份進行。原子力顯微鏡如前所述制備 dsRNA-BAPC 復合物并用天然氧化物沉積在硅襯底上。使用來自 ParkSystems (韓國)的 ParkXE7 AFM 以非接觸模式獲得地形圖像，使用標稱端直徑為14nm 并標稱彈簧常數(shù)為42N/m 的硅懸臂梁(ParkSystems，PPP-NRC)。硅襯底表面有一層薄的天然氧化物(約1-2nm)(未進行 HF/BOE 蝕刻)。

2.6.根據(jù) Mutti 等[21]的研究，豌豆蚜(Acyrthosphon pisum)被關(guān)在蠶豆屬(Viciafaba)植物的籠子里。所有的飼養(yǎng)試驗生物測定都在22 °C 下進行，并編程為16小時的光照和8小時的黑暗周期。以含5% 啤酒糟的面粉為飼料，在30 °C 下飼養(yǎng)赤擬谷盜(GA-1)昆蟲。Avila 等人?？刂漆尫烹s志273(2018)139-146140酵母在標準條件下如前所述[22,23]。通過混合70毫克黃金水牛粉(Heartland Mill，Inc.)制備了含 ds-RNA-BAPC 納米顆粒(赤擬谷盜)培養(yǎng)基的飼料，用于喂養(yǎng)10只昆蟲。如前所述，用400μL dsRNA-BAPC 復合物制備的 Marienthal，KS)。將面粉與雙鏈 RNA-BAPCs 溶液反轉(zhuǎn)幾次混合。這種混合物在真空下保持大約10小時。當混合物*干燥后，我們將其分配到96孔板中，每孔加入7毫克左右。立即，我們放置一個昆蟲每孔(幼蟲和/或蛹前階段(質(zhì)量約2毫克)。對于僅含有 dsRNA 的對照組，我們將70mg 金牛花粉與溶于400μL 水和160mM CaCl 2中的10μg Armet-，BiP- 或 Vermilion-dsRNA 混合。其他對照通過將70mg 面粉與400μL 水加減 BAPC (40μM)混合制備。我們分析了每組30-35只動物。動物被保持在30攝氏度的定時期與視覺監(jiān)測的表型和死亡率2.8.對于對照樣本，將蚜蟲放置在含有滅菌的2% 瓊脂(補充有0.1% 奇跡生長肥料和0.03% 甲基碗豆蚜)的培養(yǎng)皿中，插入健康的葉子(蠶豆) ，并喂食48小時[24]。對于 dsRNA 喂養(yǎng)試驗，將多達5只成年蚜蟲(沒有過度擁擠)用細漆刷轉(zhuǎn)移到喂養(yǎng)無菌塑料杯(Falcon，Primaria，NJ，USA)上。在含有5只昆蟲杯的塑料杯上放置一層拉伸的石蠟膜(美國費舍爾科學研究所)。將含有游離或 BAPC 綴合的 BiPdsRNA 的人工飼料(20μL)置于在杯上拉伸的膜的頂部。第二層拉伸膜被放置在飲食的頂部，從而形成口袋。蚜蟲通過穿透膜的底層進食。采用0.1 μg、0.01 μg 和0.001 μg 含12.5 mM CaCl _ 2的三種不同濃度的 dsRNA。蚜蟲被允許以這種食物為食48小時。然后將蚜蟲轉(zhuǎn)移到如前所述為對照組準備的植物葉片中。在每個實驗中，三個重復包括在人工飼料喂養(yǎng)。在每個飼養(yǎng)試驗中，每組10 × 3只蚜蟲分別進行存活試驗。每個實驗組每天進行監(jiān)測，記錄并清除死亡的成年蚜蟲和若蟲。2.9.根據(jù)制造商(Invitrogen，CA，USA)提供的提取 RNA 的方案，在1mL TRIZOL 試劑中用聚丙烯杵勻漿成年蚜蟲(10種昆蟲)。按照 tURBO 無 DNA 試劑盒(Ambion，Austin，TX)提供的方案處理 RNA 分數(shù)，可將 dsRNA 樣本中的 DNA 污染降至低。使用 SuperScript III FirstStrand 合成系統(tǒng)進行 RT-PCR (Invitrogen，CA，USA) ，將 RNA (4μg 無 DNA)反轉(zhuǎn)錄成互補DNA (cDNA)。對赤擬谷盜幼蟲(7種昆蟲)進行了類似的處理。兩種昆蟲目標基因的核苷酸序列(豌豆蚜: p-BiP: NCBI 登錄號。從 NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得 XM _ 003244000.1) ; 赤錐菌: TcBiP: XM _ 015982882.1; TcArmet: XM _ 966545.3; TcVer: NM _ 001039410)。使用 AmpliScribeTM T7 Flash TranscriptionKit 方案(Cat。沒有。美國震中生物技術(shù)公司 ASF3507)。PCR 產(chǎn)物在40mM 三醋酸鹽(pH8.3)和1mM EDTA 中制備的1.4% 瓊脂糖凝膠上分離。溴化乙錠加入至0.7 μg/mL 的最終濃度，然后讓瓊脂糖凝固。在紫外光下拍攝凝膠并通過凝膠文檔(UVP-Digital Image System，Upland，CA，USA)捕獲圖像。2.11.在未修飾的 Armet-dsRNA 的5′端引入了 Armet-dsRNA 巰基的熒光標記。使用5’0EndTAg 核酸標記試劑盒(Vector Laboratories，USA)摻入巰基官能團。隨后，我們納入了巰基反應(yīng)性熒光標記 Atto633-Maleimide (Atto-Tec GmbH，Germany)。簡而言之，將0.4 nmol 的 Armet-dsRNA 在37 °C 溫育30分鐘。與 ATPγ S 和 T4多核苷酸激酶(T4-PNK)。T4-PNK 將硫代磷酸從 ATPγ 轉(zhuǎn)移到雙鏈核酸的5′羥基上。接下來，將 Atto633-馬來酰亞胺染料加入過量的3M 中，并在室溫下孵育3小時，保持 pH = 8以確保巰基的去質(zhì)子化。在這個疾病潛伏期之后，用緩沖分離 dsRNA。在純化完成后，使用納米滴方法讀取濃度，并通過熒光測量確認標記。對于飲食制劑，熒光標記的 Armet-dsRNA 按照前面描述的方案與 BAPC 混合。接下來，將400μL (10μg)標記的 Armet-dsRNA (游離的或與 BAPC 復合的)與100mg 面粉混合。這些混合物在真空下保持大約10小時。當兩種混合物*干燥后，它們被分配到一個96孔的平板中，每孔加入10毫克以治療赤擬谷盜10的幼蟲。為了比較的目的，另外一個控制組包含只有水的飲食。

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