甲基化特異性MLPA

(MS-MLPA) 是SALSA® ^MLPA®^{技術(shù)的一種變體。通過MS-MLPA，可以同時對多個目標(biāo)進(jìn)行半定量的甲基化分析。}

MS-MLPA 探針

如同常規(guī)MLPA探針混合物，MS-MLPA探針混合物包含靶向特定基因組序列的探針。每個探針由兩部分組成：左探針寡核苷酸（LPO）和右探針寡核苷酸（RPO）。MS-MLPA探針混合物中的某些探針靶向包含甲基化敏感性HhaI內(nèi)切酶限制位點的區(qū)域。這些探針可用于甲基化分析。

MS-MLPA 的原理

探針與樣品DNA上的目標(biāo)序列雜交。然后使用HhaI酶消化未甲基化的雙鏈探針-DNA復(fù)合物。

與未甲基化樣本DNA形成的復(fù)合物被消化。消化后的探針無法呈指數(shù)級擴增，因此不會產(chǎn)生信號。與甲基化樣本DNA形成的復(fù)合物不被HhaI消化，并將產(chǎn)生正常信號。

MS-MLPA 反應(yīng)

MS-MLPA 的步驟與MLPA的步驟非常相似。最重要的區(qū)別是反應(yīng)在過夜雜交后被分為未消化和已消化的反應(yīng)。

未消化的反應(yīng)用于拷貝數(shù)測定。在消化的反應(yīng)中，用于甲基化分析，HhaI酶與Ligase-65酶同時加入。

數(shù)據(jù)分析

 用于分析數(shù)據(jù)?？截悢?shù)與常規(guī) MLPA 一樣，通過未消化反應(yīng)來確定。DNA 樣本中的甲基化百分比是通過將消化反應(yīng)中的每個探針信號與未消化反應(yīng)中的相應(yīng)信號進(jìn)行比較來確定的。

完成

對您的MLPA數(shù)據(jù)進(jìn)行完整分析。

質(zhì)量

對您的樣品和實驗進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控。

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可視化您的數(shù)據(jù)的所有方面

Coffalyser 允許您以多種方式可視化和分析您的數(shù)據(jù)。您可以查看電泳圖、表格，或者關(guān)注帶有拷貝數(shù)比率的圖表。對于更復(fù)雜的病例和故障排除，您可以查看中間分析步驟的結(jié)果。要討論或存儲您的結(jié)果，您可以將總結(jié)導(dǎo)出為 PDF。

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關(guān)于我們的產(chǎn)品的最新信息可以直接從Coffalyser內(nèi)部從我們的服務(wù)器獲取。這確保了您在收到新產(chǎn)品后即可開始分析。Coffalyser的更新始終是免費的，確保您始終從最新的見解中受益。

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# 附錄I-標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果解釋

MLPA是一種基于探針信號相對變化分析的相對技術(shù)。MLPA探針的絕對熒光信號強度（由毛細(xì)管電泳儀測量）在用于數(shù)據(jù)分析之前需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

## 標(biāo)準(zhǔn)化

 拷貝數(shù)分析

Coffalyser使用一系列標(biāo)準(zhǔn)化步驟和計算來計算最終探針比率。在稱為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化的過程中，Coffalyser通過將探針信號與一個樣本中的參考探針信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將絕對信號強度轉(zhuǎn)換為相對值。這對每個樣本都進(jìn)行。在相互標(biāo)準(zhǔn)化期間，Coffalyser將每個樣本與參考樣本進(jìn)行比較。

標(biāo)準(zhǔn)化過程的簡化版本如下：

步驟1 

將樣本1中目標(biāo)探針1（Tp1）的信號強度除以參考探針1（Rp1）的信號強度。在參考樣本1中進(jìn)行相同操作。然后將第一個值除以第二個值。

這對探針混合物中包含的每個參考探針都進(jìn)行。這導(dǎo)致目標(biāo)探針1的中間比率數(shù)量與探針混合物中的參考探針數(shù)量相同。接下來，取這些中間比率的中值。見下面的等式。

步驟2 

使用分析中包含的每個參考樣本重復(fù)步驟1。這導(dǎo)致樣本1中目標(biāo)探針1的中值數(shù)量與分析中的參考樣本數(shù)量相同。

Coffalyser然后計算這些中值的平均值。這產(chǎn)生樣本1中目標(biāo)探針1的最終比率。

這個過程對所有探針重復(fù)（除了突變特異性探針和信號非常低的探針，見第34頁的“最終比率與內(nèi)部比率百分比"部分）。

 分析中未定義參考樣本

當(dāng)分析中未定義參考樣本時，所有樣本都用于標(biāo)準(zhǔn)化。這將導(dǎo)致一個探針的中值數(shù)量與樣本數(shù)量相同。這些中值的中值是樣本中一個探針的最終比率。這個過程對所有探針和樣本重復(fù)。

 更多信息

Coffalyser中用于MLPA數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的確切程序和算法已由Coffalyser的開發(fā)人員描述（Jordy Coffa和Joost van den Berg（2011）。MRC-Holland的新型軟件Coffalyser分析MLPA數(shù)據(jù)，《現(xiàn)代質(zhì)量控制方法》，Ahmed Badr Eldin博士（編輯），InTech，

 甲基化特異性MLPA分析

MS-MLPA數(shù)據(jù)的分析分為兩部分。第一部分通過將未消化的患者樣本標(biāo)準(zhǔn)化為未消化的參考樣本來確定拷貝數(shù)，就像拷貝數(shù)分析一樣。第二部分確定樣本的甲基化狀態(tài)。這通過將消化樣本與其未消化的對應(yīng)物進(jìn)行比較來完成。

簡化來說，標(biāo)準(zhǔn)化的第二部分工作如下：

將消化樣本1中目標(biāo)探針1（Tp1）的信號強度除以參考探針1（Rp1）的信號強度。在未消化樣本1中進(jìn)行相同操作。然后將第一個值除以第二個值。

這對探針混合物中包含的每個參考探針都進(jìn)行，這將導(dǎo)致目標(biāo)探針1的中間比率數(shù)量與探針混合物中的參考探針數(shù)量相同。接下來，取這些中間比率的中值。見下面的等式。

這個過程對所有探針重復(fù)（除了突變特異性探針和信號非常低的探針，見第34頁的“最終比率與內(nèi)部比率百分比"部分）。

結(jié)果和解釋

 重要提示：

以下結(jié)果應(yīng)始終在大小調(diào)用峰圖和/或原始運行數(shù)據(jù)中目視確認(rèn)：

- 純合缺失

- 單個探針缺失和增益

- MS-MLPA結(jié)果

- 鑲嵌現(xiàn)象

- 異常和意外結(jié)果

建議也目視確認(rèn)其他結(jié)果，但這不是必需的。

 拷貝數(shù)分析

 95%置信區(qū)間

除了計算探針比率外，Coffalyser還使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)來確定結(jié)果是否可靠。為此，它為每個探針計算參考樣本的95%置信區(qū)間。這表示在100個參考樣本中，預(yù)計有95個樣本的探針比率落在該范圍內(nèi)。參考樣本上探針的95%置信區(qū)間在比率圖中描繪為彩色條（見圖1）。

此外，它還為樣本中的每個探針計算95%置信區(qū)間估計。這表示在100次對該樣本的實驗中，預(yù)計有95次實驗的探針比率落在該范圍內(nèi)。樣本中探針的95%置信區(qū)間在比率圖中描繪為圍繞計算的探針比率的誤差條，該比率表示為一個點（見圖2）。

當(dāng)這兩個95%置信區(qū)間不重疊時，可以高度確定地得出樣本中的結(jié)果與參考樣本顯著不同的結(jié)論。如果存在重疊，結(jié)果不太明確，因此不能得出結(jié)果與參考樣本不同的結(jié)論。

 任意邊界

Coffalyser還在比率圖中顯示任意邊界，為紅色（下任意邊界）和藍(lán)色（上任意邊界）線。默認(rèn)情況下，邊界設(shè)置為參考樣本上探針平均值的±0.3（在比率圖中用黃色“x"表示）。例如，當(dāng)參考樣本上探針的平均值為0.95時，下任意邊界設(shè)置為0.65（0.95-0.3），上任意邊界設(shè)置為1.25（0.95+0.3）。由于參考樣本上探針的平均值對于每個探針都是不同的（并非所有探針的比率都是1），因此任意邊界不是直線。

當(dāng)探針比率跨越這些邊界時，這表明存在重復(fù)或缺失（假設(shè)探針靶向的序列的正?？截悢?shù)為2）。然而，跨越任意邊界并不一定意味著探針的目標(biāo)序列確實被刪除或重復(fù)！例如，同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間也可能跨越任意邊界。在這種情況下，樣本中的探針結(jié)果可能與參考樣本沒有不同。

顯示結(jié)果

提供了在網(wǎng)格、比率圖和PDF報告中顯示探針結(jié)果的可能性。圖3概述了可能的探針結(jié)果以及它們在Coffalyser的不同區(qū)域中如何顯示。

情況1： 探針結(jié)果不表明拷貝數(shù)變化：在PDF報告中，比率為黑色字體，[REF]列中顯示等號（=），網(wǎng)格中顯示灰色或綠色單元格（目標(biāo)探針）和黃色單元格（參考探針）。在比率圖中，探針的95%置信區(qū)間估計與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間重疊（藍(lán)色框）。

情況2： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號顯著降低，因為計算出的降低超過兩個標(biāo)準(zhǔn)差。在PDF報告中，比率為斜體，黑色字體。在[REF]列中，這由兩個小于括號（<<）表示。在網(wǎng)格中，單元格為紫色，表示未跨越下任意邊界。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框）。

情況3： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號顯著增加，因為計算出的增加超過兩個標(biāo)準(zhǔn)差。在PDF報告中，比率為斜體，黑色字體。在[REF]列中，這由兩個大于括號（>>）表示。在網(wǎng)格中，單元格為紫色，表示未跨越上任意邊界。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框）。

情況4： 探針結(jié)果表明雜合缺失（假設(shè)探針通常靶向兩個拷貝）。計算出的降低超過兩個標(biāo)準(zhǔn)差，并且跨越了下任意邊界。在PDF報告中，比率為粗體和斜體，紅色字體。在[REF]列中，這由兩個帶星號的小于括號（<<*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為亮紅色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越下任意邊界（紅線）。

情況5： 探針結(jié)果表明雜合重復(fù)（假設(shè)探針通常靶向兩個拷貝）。計算出的增加超過兩個標(biāo)準(zhǔn)差，并且跨越了上任意邊界。在PDF報告中，比率為粗體和斜體，藍(lán)色字體。在[REF]列中，這由兩個帶星號的大于括號（>>*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為深藍(lán)色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越上任意邊界（藍(lán)線）。

情況6： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號非顯著降低，因為僅計算出一個標(biāo)準(zhǔn)差的降低。然而，跨越了下任意邊界。在PDF報告中，比率為粗體和斜體，紅色字體。在[REF]列中，這由一個帶星號的小于括號（<*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為淺紅色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越下任意邊界（紅線）。

情況7： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號非顯著增加，因為僅計算出一個標(biāo)準(zhǔn)差的增加。然而，跨越了上任意邊界。在PDF報告中，比率為粗體和斜體，藍(lán)色字體。在[REF]列中，這由一個帶星號的大于括號（>*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為淺藍(lán)色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越上任意邊界（藍(lán)線）。

情況8： 探針結(jié)果不確定，盡管（在這種情況下）跨越了下任意邊界。在PDF報告中，比率為斜體，棕色字體。在[REF]列中，這由問號（?）表示。在網(wǎng)格中，單元格為白色。在比率圖中，探針比率點為黃色。

情況9： 探針結(jié)果表明一種奇怪的、不常見的情況，其中大多數(shù)參考樣本對該探針沒有信號。比率是基于有信號的參考樣本計算的，這是危險的。這種情況最常出現(xiàn)在特殊探針混合物中，當(dāng)不使用專用參考樣本時，和/或當(dāng)選擇了不正確的參考樣本時。在PDF報告中，比率為斜體，棕色字體。在[REF]列中，這由術(shù)語INF表示。在網(wǎng)格中，單元格為橙色。在比率圖中，探針比率點為橙色。

情況10： 探針結(jié)果表明未找到信號。在PDF報告中，比率為粗體和斜體，紅色字體。在[REF]列中，這由兩個帶兩個星號的小于括號（<<）表示。在網(wǎng)格中，單元格為黃色。在比率圖中，探針比率點為紅色。

注意： 在上述情況中，假設(shè)參考樣本上探針的平均值為1.0。

分析

盡管在MS-MLPA分析中為每個探針計算了甲基化比率，但只有甲基化特異性探針（包含HhaI位點）的比率指示樣本的甲基化狀態(tài)。在Coffalyser中，這些探針在其名稱中標(biāo)記有[HhaI]。

計算的甲基化特異性探針的甲基化比率指示樣本中甲基化的拷貝數(shù)。因此，要了解樣本中探針的甲基化狀態(tài)，了解其拷貝數(shù)很重要。表1列出了一些示例。

拷貝數(shù)分析 甲基化狀態(tài)分析

最終比率拷貝數(shù)甲基化結(jié)果甲基化拷貝數(shù)

為了確定獲得的結(jié)果是否表明異常，應(yīng)將其與參考樣本的結(jié)果進(jìn)行比較，預(yù)計參考樣本在感興趣區(qū)域具有正常的拷貝數(shù)和甲基化狀態(tài)。

Coffalyser為每個探針的甲基化狀態(tài)計算參考樣本的95%置信區(qū)間（圖5中下部比率圖中的藍(lán)色框）。這表示在100個參考樣本中，預(yù)計有95個樣本的探針甲基化值落在該范圍內(nèi)。還為樣本中的每個探針計算95%置信區(qū)間估計，這表示在100次對該樣本的實驗中，預(yù)計有95次實驗的探針甲基化狀態(tài)落在該范圍內(nèi)（圖5中下部比率圖中與探針結(jié)果相關(guān)的誤差條）。

 任意邊界

Coffalyser還在拷貝數(shù)和甲基化比率圖中顯示任意邊界，為紅色（下任意邊界）和藍(lán)色（上任意邊界）線。默認(rèn)情況下，邊界設(shè)置為參考樣本上探針平均值的±0.3。例如，當(dāng)參考樣本上探針的平均值為0.95時，下任意邊界設(shè)置為0.65（0.95-0.3），上任意邊界設(shè)置為1.25（0.95+0.3）。在甲基化圖中，參考樣本上探針的平均值對于每個探針都是不同的（例如，由于HhaI限制位點的存在、實驗變異），因此任意邊界不是直線。

當(dāng)探針的甲基化狀態(tài)跨越這些邊界時，這表明與參考樣本相比甲基化狀態(tài)存在差異。然而，跨越任意邊界并不一定意味著探針的目標(biāo)序列的甲基化狀態(tài)確實異常！例如，同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間也可能跨越任意邊界。在這種情況下，樣本中的探針結(jié)果可能與參考樣本沒有不同。

 在Coffalyser中顯示結(jié)果

在比較分析實驗資源管理器中，Coffalyser默認(rèn)將樣本的未消化和消化對應(yīng)物的結(jié)果直接相鄰顯示（見圖4）。

在比較分析樣本結(jié)果資源管理器的比率圖選項卡中，Coffalyser通常顯示兩個比率圖。對于所選樣本，上部圖表顯示未消化對應(yīng)物的結(jié)果，即拷貝數(shù)分析，下部圖表顯示MLPA反應(yīng)的消化對應(yīng)物的結(jié)果，即甲基化狀態(tài)分析（見圖5）。

也可以比較分析實驗資源管理器的比率概述選項卡和比較分析樣本結(jié)果資源管理器的比率圖選項卡中分別查看未消化或消化樣本的結(jié)果。

程序：更改比較分析實驗資源管理器的比率概述選項卡中的結(jié)果顯示

1. 在比較分析實驗資源管理器的RATIO OVERVIEW選項卡中，右鍵單擊并選擇Show Data Type。

2. 從出現(xiàn)的列表中選擇DNA或MS，分別僅顯示未消化樣本或消化樣本的結(jié)果。

3. 要再次查看組合結(jié)果，請按照步驟1和2并選擇DNA/MS。

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