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Emsdiasum常見問題解答
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Emsdiasum產(chǎn)品-緩沖液

Emsdiasum產(chǎn)品-緩沖液  Emsdiasum常見問題解答

Emsdiasum常見問題解答

我應(yīng)該使用什么樣的粒度?

始終使用最小的顆粒大小來適合您的應(yīng)用?;谳^小顆粒的共軛比基于較大顆粒的共軛更有效。如果使用較小的粒子難以顯示,則可以使用銀增強(qiáng)來放大這些粒子,這是Ultra Small系列共軛物的備條件。新的銀增強(qiáng)系統(tǒng)AURION SE-EM提供均勻高效的增強(qiáng)。

金綴合物真的比其他綴合物更傾向于背景嗎?

不這個(gè)童話故事來源于這樣一個(gè)事實(shí),即金共軛物是基于粒子的,而可視化也是基于單獨(dú)的粒子的。與酶和熒光標(biāo)記相反,金綴合物更像一個(gè)數(shù)字系統(tǒng),要么它們在那里,然后你會(huì)看到它們,要么它們不存在。酶和熒光標(biāo)記很快被認(rèn)為是類似物"標(biāo)記,它們在檢測中的可見度隨著其局部濃度或酶標(biāo)記產(chǎn)生可見反應(yīng)產(chǎn)物的時(shí)間而增加。對(duì)熒光對(duì)照的無偏見觀察顯示,生物化合物中存在雙鍵所固有的低水平光,最重要的是來自標(biāo)記抗體的熒光。同樣,對(duì)僅用堿性磷酸酶或過氧化物酶標(biāo)記的抗體孵育的對(duì)照樣品進(jìn)行無偏見的觀察,通常會(huì)顯示出樣品的整體染色微弱。這種微弱的水平很容易被接受,甚至在心理上被過濾掉。你不能用金共軛物做這件事,因?yàn)樗鼈兪腔诹W拥摹?/span>

我應(yīng)該使用二級(jí)金綴合物或蛋白a(或G)嗎?

這取決于你的目標(biāo)是什么。使用次級(jí)綴合物會(huì)產(chǎn)生更高的標(biāo)記密度。因此,人們常說次級(jí)綴合物比蛋白A綴合物更敏感。這在一定程度上是正確的。蛋白質(zhì)A(或G)僅識(shí)別一級(jí)抗體分子上的一個(gè)位點(diǎn)。只有當(dāng)此站點(diǎn)可用且不被其環(huán)境遮擋時(shí),才會(huì)發(fā)生綁定。次級(jí)綴合物識(shí)別初級(jí)上更多的位點(diǎn),因此檢測到初級(jí)抗體的可能性更大。本質(zhì)上,這是靈敏度的提高。

有沒有免疫金(銀)染色的培訓(xùn)計(jì)劃,我可以自己帶標(biāo)本?

EMSAurion組織濕式工作坊,您最好使用自己的樣本和初級(jí)抗體。畢竟,這就是你的興趣所在。如果需要,我們將把活動(dòng)擴(kuò)展到其他場地。研討會(huì)持續(xù)兩三天,對(duì)免疫金(銀)染色進(jìn)行了深入探討。參與者人數(shù)有限,以保證最佳教學(xué)。您可以直接聯(lián)系我們了解更多信息。有關(guān)我們研討會(huì)設(shè)置的詳細(xì)信息,請(qǐng)?jiān)L問本網(wǎng)站。

有可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行預(yù)包埋標(biāo)記嗎?

對(duì)單細(xì)胞是最合適的。植物材料有一層厚厚的不可穿透的墻,而不是。超小型金綴合物是選的綴合物。在許多情況下,NaBH4的滲透步驟足以打開樣品并允許試劑滲透。低濃度的溫和清潔劑,如皂苷,有助于清潔。需要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是:必須延長反應(yīng)時(shí)間,因?yàn)楸仨殞?shí)現(xiàn)試劑對(duì)內(nèi)部抗原的全滲透。為了在孵育后去除未反應(yīng)的試劑,必須同樣調(diào)整洗滌程序!《Aurion通訊》第5期討論了這個(gè)話題。請(qǐng)參閱本網(wǎng)站的其他地方。

如何驗(yàn)證我的綴合物是否仍然有效?

有一個(gè)簡單的程序來檢查這一點(diǎn)。它在Aurion的通訊#4中有非常詳細(xì)的描述,一些信息可以在本網(wǎng)站的通訊"部分找到。簡而言之:你需要一個(gè)硝基纖維素條,從一級(jí)抗體的稀釋系列中涂上點(diǎn),然后用金試劑孵育條。這些點(diǎn)會(huì)被較大的共軛物染成紅色。測試超小型共軛銀時(shí),必須應(yīng)用銀增強(qiáng)進(jìn)行可視化。

如何驗(yàn)證銀增強(qiáng)試劑是否仍然正常?

同樣,有一個(gè)簡單的過程來檢查這一點(diǎn)。它在我們的第4號(hào)通訊中有詳細(xì)描述(請(qǐng)參閱本網(wǎng)站的通訊"部分)。簡言之:你需要一個(gè)硝基纖維素條,從你的金綴合物的稀釋系列中涂上點(diǎn),然后用銀增強(qiáng)試劑孵育條。圓點(diǎn)應(yīng)變成棕黑色。在這段時(shí)間內(nèi),試劑混合物應(yīng)保持玻璃透明,無任何由自成核引起的可見銀存在。

電子顯微鏡用銀增強(qiáng)試劑SE-EM的活性可以通過向100µl增強(qiáng)混合物中加入10µl稀釋的超小型試劑來測試。溶液應(yīng)在30-45分鐘內(nèi)變黃。

建議使用過時(shí)的共軛詞嗎?

只要它們的反應(yīng)性良好,并且沒有形成太多的團(tuán)簇,這就沒有問題。金共軛物非常穩(wěn)定。隨著時(shí)間的推移,可能會(huì)有一些蛋白質(zhì)從顆粒表面釋放,但通常這不會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性顯著降低。如通訊#4所述,結(jié)合物的反應(yīng)性很容易通過點(diǎn)點(diǎn)測試進(jìn)行檢查。根據(jù)結(jié)合蛋白的類型和顆粒大小,簇的形成可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加。粒子越大,簇越多。這些可以在使用前通過離心稀釋的綴合物來去除。

是否可以使用來自同一動(dòng)物源的兩種抗體進(jìn)行雙重標(biāo)記?

是的,有辦法做到這一點(diǎn)。一種是通過使用具有不同粒徑的蛋白G或蛋白A綴合物。程序是:首先用一級(jí)抗體I孵育,用粒徑較小的蛋白A(或G)檢測。然后加入過量游離蛋白AG50-100µG/ml)孵育。這將幾乎阻斷蛋白AG的所有結(jié)合位點(diǎn)。接下來,用一級(jí)抗體II孵育第二種抗原,并用更大尺寸的AG蛋白金綴合物檢測。第二種可能性是用一級(jí)抗體的混合物進(jìn)行一步孵育,每個(gè)抗體直接用不同的金粒徑標(biāo)記??商峁┒ㄖ茦?biāo)簽服務(wù)。

我應(yīng)該使用什么樣的網(wǎng)格進(jìn)行銀色增強(qiáng)?

鎳是選材料。黃金網(wǎng)格是不可能的,因?yàn)樗鼈円矊⒈徽R地增強(qiáng)。銅也是如此。無論如何,鎳網(wǎng)格比銅網(wǎng)格更適合免疫培養(yǎng),因?yàn)殒噷?duì)免疫或酶反應(yīng)更具惰性,毒性更小。鎳網(wǎng)格由于其磁性而令人討厭。通過使用非磁性鑷子或使用電子顯微鏡科學(xué)美回路"在免疫培養(yǎng)期間將網(wǎng)格從液滴轉(zhuǎn)移到液滴,可以很容易地克服這一問題。

銀增強(qiáng)和OsO4怎么樣?

OsO4固定可在孵育前、孵育后或銀增強(qiáng)后使用。

由于其對(duì)抗原OsO4的破壞作用,當(dāng)打算進(jìn)行免疫培養(yǎng)時(shí),通常不使用固定。然而,一般來說,銀增強(qiáng)免疫孵育的OsO4固定標(biāo)本不會(huì)造成任何困難。

孵育后可引入鋨固定步驟,以提高樣品的對(duì)比度。如前所述,應(yīng)用銀增強(qiáng)通常不會(huì)造成任何困難。

增強(qiáng)后使用OsO4固定也是可能的,但由于OsO5是一種強(qiáng)氧化劑,它能夠氧化金屬銀,特別是當(dāng)以顆粒形式存在時(shí)。這導(dǎo)致部分銀被去除。一種簡單的補(bǔ)救方法是將稍微增強(qiáng)的樣品與有限的OsO4固定相結(jié)合,例如1%OsO5分鐘。

我沒有得到積極的結(jié)果,現(xiàn)在怎么辦?

當(dāng)孵育的標(biāo)本看起來和對(duì)照一樣干凈時(shí),要么(一種或多種)試劑不活躍,要么抗原被破壞、掩蓋或缺失。如通訊#4(請(qǐng)參閱本網(wǎng)站的通訊"部分)中所述,通過使用點(diǎn)點(diǎn)測試反向進(jìn)行孵化協(xié)議測試,很容易找到原因。

首先測試所用金綴合物上的銀增強(qiáng)試劑(如果使用的話)的活性。如果銀增強(qiáng)是好的,下一步是在使用的一級(jí)抗體上測試金綴合物,等等。如果它證明問題不在試劑中,你將不得不研究抗原保存。是否應(yīng)進(jìn)行不同的固定?或者不同的嵌入介質(zhì)?使用光顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,無需繁瑣的EM實(shí)驗(yàn)工作即可回答這些問題。

我有背景問題;這是因?yàn)榻鸸曹梿幔?/span>

當(dāng)標(biāo)本被正確阻斷并且使用了正確的培養(yǎng)緩沖液成分和條件時(shí),背景水平不應(yīng)干擾特定信號(hào)。某些背景總是存在的:在某種程度上,所有化合物對(duì)其他化合物都有一定的親和力,根據(jù)可用性和濃度,可能會(huì)發(fā)生相互作用。在這方面沒有絕對(duì)的黑白之分。

當(dāng)你放棄了一級(jí)抗體培養(yǎng),只使用黃金步驟,而你的背景已經(jīng)大大降低,那么你的一級(jí)抗體就會(huì)導(dǎo)致背景。補(bǔ)救措施:通過親和層析(抗血清)和/或交叉吸附純化一級(jí)抗體。如果在不使用初級(jí)培養(yǎng)的情況下,你的背景水平不可接受,那么樣本有可能與金綴合物結(jié)合。

背景可能有許多原因,圍繞三種不同類型的相互作用:

通過在蛋白質(zhì)阻斷步驟之前使用NaBH4或氨酸阻斷步驟消除的殘余固定活性,

對(duì)疏水區(qū)域的粘性(包埋介質(zhì)、富含脂質(zhì)的樣品化合物)。這通過使用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)阻斷步驟來減少,所述蛋白質(zhì)阻斷步驟涉及部分疏水性蛋白質(zhì),

基于電荷的相互作用導(dǎo)致帶負(fù)電荷的試劑(如抗體和金綴合物)粘附在樣品中帶相反電荷的區(qū)域(臭名昭著的是組蛋白、一些膠原類型和聚賴氨酸,有時(shí)用于使切片粘在表面)。這種類型的相互作用只能通過向培養(yǎng)基中添加過量的帶負(fù)電荷的無關(guān)分子來克服。Aurion開發(fā)了一種化學(xué)修飾的BSA,稱為BSA-c™ 特別是為此目的。通訊#1提供了深入的信息。新聞稿可在此處在線獲取。

有什么論壇我可以回答關(guān)于標(biāo)簽或顯微鏡的問題嗎?

請(qǐng)隨時(shí)通過電子郵件聯(lián)系我們的幫助臺(tái),關(guān)于免疫標(biāo)記的問題。

有一些新聞組可能感興趣,如:生物網(wǎng)。細(xì)胞生物、生物網(wǎng)、細(xì)胞生物。細(xì)胞網(wǎng),bionet.molbio。方法采用免疫細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)方法。有一個(gè)顯微鏡ListServer,您可以訂閱它,它提供了一個(gè)平臺(tái),可以從各個(gè)方面詢問有關(guān)光學(xué)和電子顯微鏡的問題。您可以通過向發(fā)送電子郵件進(jìn)行訂閱該消息只需包含訂閱顯微鏡"一詞。

 

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