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運(yùn)動(dòng)蛋白資源目錄

運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)類(lèi)

真核驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白利用ATP水解的能量沿著細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)移動(dòng)貨物，如染色體和小泡[1]。它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)膸缀跛蟹矫娑及l(fā)揮著重要作用，并參與廣泛的生理過(guò)程，包括胚胎發(fā)育[2]、軸突運(yùn)輸[3]和細(xì)胞分裂[4]。。。（點(diǎn)擊此處了解更多關(guān)于運(yùn)動(dòng)蛋白的信息）。

運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)常見(jiàn)問(wèn)題

問(wèn)題1：如何使用驅(qū)動(dòng)蛋白進(jìn)行藥物篩選？

答案1：動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白利用微管（MT）作為底物，在細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)各種動(dòng)力學(xué)事件。它們已經(jīng)被證明可以沿著MT軌道運(yùn)送染色體和血管等貨物。驅(qū)動(dòng)蛋白通過(guò)水解利用ATP的能量來(lái)發(fā)揮作用，這種活性在MT存在的情況下會(huì)大大增強(qiáng)。為了篩選調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)蛋白和MT之間相互作用的藥物，MT激活的驅(qū)動(dòng)蛋白ATP酶測(cè)定可以用作驅(qū)動(dòng)蛋白的MT激活的ATP酶活性的測(cè)試。細(xì)胞骨架開(kāi)發(fā)了兩種這樣的測(cè)定法，一種是終點(diǎn)測(cè)定法，另一種是動(dòng)力學(xué)測(cè)定法，可用于發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化驅(qū)動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)劑。兩種測(cè)定都測(cè)量由微管激活的驅(qū)動(dòng)蛋白三磷酸腺苷（ATP酶）活性產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷酸鹽（Pi）水平。這兩種驅(qū)動(dòng)蛋白-ATP酶生物化學(xué)分析試劑盒（Cat.#BK053和BK060）提供MT和驅(qū)動(dòng)蛋白重鏈（KHC）蛋白以及必要的緩沖液和試劑，以測(cè)量Pi的產(chǎn)生，作為篩選調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)蛋白和/或MT功能相互作用的藥物的手段。這些試劑盒可用于發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白抑制劑和激活劑（Cat.#BK053和BK060）以及測(cè)定驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白的Vmax和Kcat值（Cat.#BK060。

問(wèn)題2：有哪些試劑盒可用于表征推定的運(yùn)動(dòng)蛋白？

答案2：運(yùn)動(dòng)蛋白利用微管作為底物，這意味著運(yùn)動(dòng)蛋白是微管相關(guān)蛋白（MAP）的一種類(lèi)型。為了證實(shí)推定的運(yùn)動(dòng)蛋白與微管結(jié)合，可獲得Cytoskeley的微管結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)下降測(cè)定試劑盒（Cat.#BK029）。待評(píng)估的蛋白質(zhì)需要通過(guò)考馬斯藍(lán)或銀染色或用蛋白質(zhì)本身的抗體或與蛋白質(zhì)綴合的標(biāo)簽（his、myc等）進(jìn)行可視化。不可水解的ATP類(lèi)似物，例如AMPPNP，通常以5或10mM使用以維持微管附著。微管還激活運(yùn)動(dòng)蛋白的ATP酶活性，這可以用我們的驅(qū)動(dòng)蛋白ATP酶測(cè)定法之一（Cat.#BK053或BK060）來(lái)測(cè)量。這些試劑盒可用于發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白抑制劑和激活劑（Cat.#BK053和BK060）以及測(cè)定驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白的Vmax和Kcat值（Cat.#BK060。Cytoshelle，股份有限公司還提供Biochem試劑盒（Cat.#BK027），其允許使用熒光標(biāo)記的微管可視化運(yùn)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)。

技術(shù)支持

時(shí)間：周一至周五，山地標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間上午8點(diǎn)至下午5點(diǎn)

Cytoskeley的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)提供無(wú)與比的服務(wù)和支持，讓您與擁有開(kāi)發(fā)和測(cè)試我們?cè)诂F(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的分析、試劑盒和試劑第一手經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家取得聯(lián)系。您可以上述號(hào)碼致電我們的技術(shù)服務(wù)小組，或通過(guò)上述電子郵件地址以電子方式提交您的問(wèn)題。問(wèn)題通常會(huì)在一個(gè)工作日內(nèi)通過(guò)電話或電子郵件回復(fù)。還請(qǐng)務(wù)必查看我們的常見(jiàn)問(wèn)題解答、技術(shù)提示和其他產(chǎn)品信息，這些信息可以通過(guò)產(chǎn)品類(lèi)別或目錄號(hào)訪問(wèn)。

運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)

Cytoskeley Motor-Werks™（CMW）產(chǎn)品線由Cytoskelle家生產(chǎn)和銷(xiāo)售。這些產(chǎn)品促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)蛋白領(lǐng)域的研究和藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)展（Funk等人，2005）。我們專(zhuān)注于生產(chǎn)高純度和生物活性的真核生物和真菌來(lái)源的驅(qū)動(dòng)蛋白和肌球蛋白家族蛋白。這些試劑用于抗有絲分裂藥物的發(fā)現(xiàn)和運(yùn)動(dòng)活性的機(jī)制研究。Cytoskeley Motor-Werks™生產(chǎn)線還包含幾種Biochem試劑盒™、抗體和其他與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的試劑（如微管穩(wěn)定劑紫醇，Cat.#TXD01）和蛋白質(zhì)（如預(yù)形成的微管，Cat.#MT002）。

有關(guān)運(yùn)動(dòng)蛋白的更多信息，請(qǐng)單擊上面的“關(guān)于"選項(xiàng)卡。

概述

真核驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)蛋白利用ATP水解的能量沿著細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)移動(dòng)貨物，如染色體和小泡[1]。它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)膸缀跛蟹矫娑及l(fā)揮著重要作用，并參與廣泛的生理過(guò)程，包括胚胎發(fā)育[2]、軸突運(yùn)輸[3]和細(xì)胞分裂[4]。許多驅(qū)動(dòng)蛋白在細(xì)胞分裂中的重要作用，以及驅(qū)動(dòng)蛋白的過(guò)度表達(dá)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等癌癥有關(guān)[5]，使它們成為抗有絲分裂癥發(fā)展的非常有吸引力的靶點(diǎn)。觀察到許多驅(qū)動(dòng)蛋白僅在細(xì)胞分裂過(guò)程中表達(dá)，這也表明它們可能優(yōu)于目前的抗有絲分裂藥物靶點(diǎn)，如普遍表達(dá)的微管蛋白[6，7]。

Kinesins的一般結(jié)構(gòu)

所有驅(qū)動(dòng)蛋白的標(biāo)志是存在一個(gè)保守的~340個(gè)氨基酸的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域[8]。這個(gè)領(lǐng)域分為兩個(gè)主要部分。第一部分是催化核心區(qū)，由催化ATP水解的ATP結(jié)合位點(diǎn)[9]和將馬達(dá)束縛在MT軌道上的微管（MT）結(jié)合位點(diǎn)[10]組成。第二部分是約10-40個(gè)氨基酸的頸部區(qū)域，被認(rèn)為有助于單向運(yùn)動(dòng)[11]。在球狀運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域之外，存在一個(gè)α-螺旋卷曲螺旋區(qū)，參與蛋白質(zhì)的同源和異源寡聚，最常見(jiàn)的是以同源二聚體的形式存在。這個(gè)區(qū)域被稱(chēng)為莖[8]。柄通常將運(yùn)動(dòng)域與稱(chēng)為尾部的第二個(gè)球狀域分開(kāi)。尾部域被認(rèn)為與貨物綁定有關(guān)。

Kinesin分類(lèi)與結(jié)構(gòu)多樣性

迄今為止，從酵母（釀酒酵母含有6種驅(qū)動(dòng)蛋白）、真菌到人類(lèi)（目前有13種驅(qū)動(dòng)肽[12]），已經(jīng)在生物體中鑒定出約150種驅(qū)動(dòng)素。分類(lèi)基于運(yùn)動(dòng)域同源性，特別是在特定類(lèi)別的頸部和鄰近區(qū)域[12]。目前人們一致認(rèn)為驅(qū)動(dòng)蛋白至少有九類(lèi)[12，13，14]。如表1所示。命名法（表1中以粗體顯示）基于運(yùn)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域在驅(qū)動(dòng)蛋白中的位置，因此N-蛋白在蛋白的氨基末端含有運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域，而C-和M-運(yùn)動(dòng)蛋白分別位于蛋白的羧基末端和中間[12]。

Cytoskeley提供的重組驅(qū)動(dòng)蛋白已被設(shè)計(jì)為結(jié)合運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域，包括頸部區(qū)域和大部分柄結(jié)構(gòu)域，這些構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生正常的二聚體結(jié)構(gòu)，盡管這尚未通過(guò)沉淀分析進(jìn)行測(cè)試。在給定類(lèi)別的驅(qū)動(dòng)蛋白中，約340個(gè)氨基酸的運(yùn)動(dòng)區(qū)的同源性可以在N-1類(lèi)（最高度保守的囊泡運(yùn)輸運(yùn)動(dòng)）的74-81%同一性和C類(lèi)（最發(fā)散的）的46-50%同一性之間變化[13]。類(lèi)之間的同一性百分比下降到35-40%[13]左右。對(duì)現(xiàn)有運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)比較表明，不同驅(qū)動(dòng)蛋白類(lèi)別的運(yùn)動(dòng)之間存在顯著的構(gòu)象變異，結(jié)構(gòu)差異集中在六個(gè)區(qū)域，其中大多數(shù)在微管結(jié)合或?qū)⒑诵倪\(yùn)動(dòng)與柄區(qū)連接方面具有重要的功能[9，11]?？紤]到不同驅(qū)動(dòng)蛋白類(lèi)別的馬達(dá)之間相對(duì)較高的百分比差異，很可能會(huì)確定類(lèi)別特異性驅(qū)動(dòng)蛋白藥物。這一結(jié)構(gòu)證據(jù)得到了生物化學(xué)數(shù)據(jù)的支持，這些數(shù)據(jù)表明，不同種類(lèi)的果蠅驅(qū)動(dòng)蛋白對(duì)各種ATP類(lèi)似物的利用不同[15]?？紤]到ATP結(jié)合口袋是運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域中最高度保守的區(qū)域之一，這一點(diǎn)令人印象深刻[9]。這些實(shí)驗(yàn)表明，即使在給定的物種內(nèi)，驅(qū)動(dòng)蛋白類(lèi)別之間也存在明顯的結(jié)構(gòu)差異，可以用于選擇性藥物開(kāi)發(fā)。在這方面，令人鼓舞的是，我們已經(jīng)能夠在HTS測(cè)定中檢測(cè)驅(qū)動(dòng)蛋白之間的類(lèi)似物特異性（見(jiàn)I期報(bào)告）。因此，我們相信，我們將能夠檢測(cè)出具有潛在抗癌藥物用途的類(lèi)特異性化合物。

*大膽的分類(lèi)系統(tǒng)取自Hirokawa[12]。括號(hào)中的分類(lèi)系統(tǒng)在文獻(xiàn)中經(jīng)常使用，取自Moore和Endow[14]。

**An，巢狀曲霉：Hs，智人：Dm，黑腹果蠅。

黃色/綠色陰影表示僅在細(xì)胞分裂中起作用的驅(qū)動(dòng)蛋白類(lèi)別，淺黃色陰影表示包含在細(xì)胞分裂或有絲分裂中起功能的驅(qū)動(dòng)素類(lèi)別，未陰影區(qū)域表示僅參與囊泡運(yùn)輸?shù)尿?qū)動(dòng)肽。

尋找潛在的抗真菌藥物需要我們識(shí)別一類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，如上所述，運(yùn)動(dòng)區(qū)域在任何給定類(lèi)別的驅(qū)動(dòng)蛋白中的變化都小于類(lèi)別之間的變化。在這方面有兩點(diǎn)值得注意；首先，我們的主要真菌靶標(biāo)是BimC蛋白，它屬于最多樣化的驅(qū)動(dòng)蛋白類(lèi)，在運(yùn)動(dòng)區(qū)內(nèi)表現(xiàn)出約47%的同一性（任何低于60%的同一度都被認(rèn)為是可接受的差異靶標(biāo)特異性），其次，我們?cè)谥亟M蛋白靶標(biāo)中包括了高度可變的柄區(qū)（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法），它提供了相對(duì)蛋白質(zhì)特異性的靶標(biāo)（<20%同一性）[13]。重要的是，對(duì)柄區(qū)的抗體抑制已被證明可抑制體內(nèi)運(yùn)動(dòng)功能[16]。

用于HTS測(cè)定的Kinesin靶點(diǎn)的選擇

驅(qū)動(dòng)蛋白的細(xì)胞功能可分為兩大類(lèi)；膜囊泡和細(xì)胞器的運(yùn)輸和定位，以及有絲分裂紡錘體的形態(tài)發(fā)生和染色體運(yùn)動(dòng)[12]。一類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白在功能上有許多相似之處，這并不奇怪。從表1中可以看出，九類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)中有四類(lèi)專(zhuān)門(mén)參與細(xì)胞分裂（表1的黃色/綠色陰影區(qū)域），兩類(lèi)（C-和M-）同時(shí)含有囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和有絲分裂運(yùn)動(dòng)（表1中的淺黃色陰影區(qū)域）；三類(lèi)（N-I、NIII和N-IV）專(zhuān)門(mén)參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)（表1未陰影區(qū)域）。

我們從每一類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白[6，17，21，22，26，28，29，30，39]中選擇了一種人類(lèi)同源物，并從人類(lèi)病原體曲霉菌中選擇了兩種真菌驅(qū)動(dòng)蛋白[34]，作為HTS測(cè)定的基礎(chǔ)（如表1所示）。通過(guò)用化合物文庫(kù)篩選每種蛋白質(zhì)，可以生成一個(gè)初級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)將允許鑒定選擇性靶向細(xì)胞分裂特異性類(lèi)人驅(qū)動(dòng)蛋白的化合物（表1的深色陰影區(qū)域），同時(shí)對(duì)囊泡運(yùn)輸驅(qū)動(dòng)蛋白沒(méi)有影響。這類(lèi)化合物最有可能是治療人類(lèi)疾病如癌癥的有效抗有絲分裂劑。同樣，與驅(qū)動(dòng)素曲霉菌特異性反應(yīng)的化合物可以作為潛在的抗真菌藥物進(jìn)行研究。

Kinesins作為有效的抗有絲分裂靶點(diǎn)

在開(kāi)始一項(xiàng)昂貴的藥物發(fā)現(xiàn)計(jì)劃之前，必須嚴(yán)格評(píng)估所提出的蛋白質(zhì)是否符合有效藥物靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。驅(qū)動(dòng)蛋白將成為抗有絲分裂藥物開(kāi)發(fā)的優(yōu)秀靶點(diǎn)的證據(jù)來(lái)自一系列實(shí)驗(yàn)方法，包括突變分析[40]、抗體抑制實(shí)驗(yàn)[7，32]和驅(qū)動(dòng)蛋白活性的反義抑制[19]。表1總結(jié)了這一證據(jù)，其中可以看出，對(duì)給定的有絲分裂特異性驅(qū)動(dòng)蛋白的功能性抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂的抑制。例如，通過(guò)向HeLa細(xì)胞中微量注射抗-Eg5抗體對(duì)HsEg5的體內(nèi)抑制導(dǎo)致>80%的細(xì)胞停止有絲分裂。使用過(guò)表達(dá)的HsEg5運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域突變體證實(shí)了這些結(jié)果[7]。在另一組實(shí)驗(yàn)中，人類(lèi)細(xì)胞系中無(wú)運(yùn)動(dòng)CENP-E蛋白的體內(nèi)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致染色體在中期板上排列失敗，并導(dǎo)致有絲分裂阻滯[22]。此外，向HeLa細(xì)胞微量注射CENP-E抗體也會(huì)導(dǎo)致持續(xù)4至17小時(shí)的有絲分裂阻滯，并導(dǎo)致所有細(xì)胞進(jìn)入凋亡[22]。由于這兩種蛋白質(zhì)都包含在我們的HTS測(cè)定中，我們非常希望針對(duì)這些馬達(dá)的化合物具有治療相關(guān)性。有趣的是，N-V類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白（表1）含有與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤有關(guān)的人類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白[5]。這種運(yùn)動(dòng)的非洲爪蟾同源物的反義和抗體抑制導(dǎo)致有絲分裂阻滯和細(xì)胞死亡[19]這一事實(shí)令人鼓舞，表明靶向人類(lèi)促色蛋白的藥物可能在治療/預(yù)防視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤方面有用。

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